第 1 章 氨基酸

知识概要

==氨基酸的分类==

疏水 (hydrophobic) 氨基酸

Phe, Ala, Leu, Met, Ile, Trp, Pro, Val

亲水 (hydrophilic) 氨基酸

Basic: His, Arg, Lys
Polar uncharged: Cys, Gly, Gln, Asn, Ser, Tyr, Thr
Acidic: Asp, Glu

必需氨基酸 (essential AAs)

指人体或动物体必不可少，但却不能合成，或者虽能合成，但合成量不够，必须从食物中补充的氨基酸，包含：
Lys 赖, Trp 色, Phe 苯丙, Met 甲, Thr 苏, Ile 异亮, Leu 亮, Val 缬, ==Arg 精, His 组 (semi-essential 半必须)==

非必需氨基酸

Ala 丙, Asn 天冬酰胺, Asp 天冬, Gln 谷氨酰胺, Glu 谷, Pro 脯, Ser 丝, Cys 半胱, Tyr 酪, Gly 甘

氨基酸的==性质==

共同性质

  • 缩合反应 (condensation)
    $$
    \ce{-COOH + H2N\bond{-} ->[enzyme] -CO-NH\bond{-} + H2O}
    $$

  • 手性 (chirality)
    除甘氨酸 Gly 以外均为手性分子，均为 L 型。

  • 酸碱解离性质与两性离子
    $\ce{-NH2}$ 解离呈碱性，$\ce{-COOH}$ 解离呈酸性，弱于单独存在的胺和羧酸。
    一个氨基酸分子内部的酸碱反应使氨基酸能同时带有正负两种电荷，以这种形式存在的离子被称为两性离子 (zwitterions)

  • 氨基酸等电点 (isoelectric point, pI) 的计算
    分析解离过程，找到净电荷为 0 的解离区间，取区间上下界的 $\mathrm p K_\text a$ 取平均值。（见 Week 3 作业）

  • R 基团的结构变化和化学反应性质

    反应类型 反应试剂 主要反应产物 用途
    $\alpha$-氨基 $\ce{HNO2}$ 羟酸，$\ce{N2}$ Van Slyke 定氮
    $\alpha$-氨基 2,4–二硝基氟苯 (DNFB)
    苯异硫氰酸酯 (PITC)    		 DNP-AA
    PTC AA, PTH AA    		 多肽和蛋白质 N–端氨基酸的鉴定
    $\alpha$-氨基
    $\alpha$-羧基    		 茚三酮 紫色物质
    ==Pro 为黄色物质==    		 氨基酸的定性和定量
==个别氨基酸的侧链性质对蛋白质功能的贡献==
  • 三种芳香族氨基酸 (Phe 苯丙, Tyr 酪, Trp 色) 含有的苯环结构赋予蛋白质紫外吸收性质，最大吸收峰为 280nm
  • 疏水氨基酸侧链间形成疏水键驱动蛋白质折叠
  • ==侧链含 $\ce{-OH}$ 的氨基酸 (Ser 丝, Thr 苏, Tyr 酪) 可作为亲核试剂参与多种酶的催化，还可以被磷酸化修饰调节多种酶的活性==
  • 两个 Cys 半胱 残基侧链 $\ce{-SH}$ 氧化为 $\ce{-S-S\bond{-}}$ 可用来稳定蛋白质三维结构
  • 碱性氨基酸
    • ==His 组== 侧链咪唑基 $\mathrm p K_\text a \approx 7$，在生理 pH 下既可以充当质子供体，又可以充当质子受体，从而[参与多种酶的催化](#广义的酸碱催化 general acid-base catalysis)。
    • ==Lys 赖 和 Arg 精== 侧链上的氨基和胍基既可以作亲核试剂，参与多种酶的催化，也可以发生共价修饰，如乙酰化和甲基化
  • ==Asp 天冬 和 Glu 谷== 的侧链在特定条件下可以作为质子供体/受体参与酶的催化

名词解释

  • non-proteinogenic AAs
    非蛋白质氨基酸，非标准氨基酸
    在蛋白质生物合成时不能直接参入到肽链之中的氨基酸。
  • proteinogenic AAs
    蛋白质氨基酸，标准氨基酸
    由遗传密码直接编码，在蛋白质生物合成中，由专门的 tRNA 携带，直接参入到正在延伸的肽链之中的氨基酸。
  • essential AAs, EAAs
    必需氨基酸
    人体或动物体必不可少，但却不能合成，或者虽能合成，但合成量不够，必须从食物中补充的氨基酸。
  • zwitterion
    两性离子，兼性离子
    同时带有正负电荷但总体呈电中性的分子化合物。
  • isoelectric point, pI
    等电点
    使分子解离出静电荷为零的 pH 值。
  • hydropathy
    疏水性
    基团对疏水环境的相对亲和能力。
  • electrophoresis
    电泳
    带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极做定向移动的现象。
  • chromatography
    层析

第 2 章 蛋白质的结构

知识概要

肽的结构

  • ==肽 (peptide) 就是氨基酸之间发生缩合反应后通过酰胺键或肽键相连的聚合物。==

  • 构成肽的每一个氨基酸单位被称为氨基酸残基 (residue)。

  • 肽的分类主要依据氨基酸残基的数目

    • 2个氨基酸形成的肽 → 二肽
    • 3个氨基酸构成的肽 → 三肽，以此类推

  • 依据氨基酸残基的数目，肽可分为

    • 寡肽 (Oligopeptide) 2~10 aa
    • 多肽 (Polypeptide) 11~50 aa
    • 和蛋白质 (Protein) >50 aa

  • 天然存在的活性肽：

    类型和种类 来源 类别 功能 备注
    谷胱甘肽（非核糖体合成） 动植物细胞 三肽 抗氧化 第一个肽键为$\gamma$-肽键
    促甲状腺素释放因子 TRF（核糖体合成） 下丘脑 三肽 促进甲状腺激素释放 N– 端发生焦谷氨酰化，C– 端发生酰胺化

==蛋白质的结构==

  • 蛋白质可能含有一条或多条肽链。

    • 一条多肽链：单体蛋白 (monomeric protein)
    • 多条多肽链：寡聚蛋白 (multimeric protein)
      • 同种肽链：同源寡聚体
      • 两种或多种不同肽链：异源寡聚体
        e.g. Hb, 2 $\alpha$-chain and 2 $\beta$-chain.

  • 蛋白质可能含有非蛋白质成分。

    • 多肽链 + 辅助因子：金属离子、辅酶/辅基
      e.g. 羧肽酶 辅助因子 $\ce{Zn^{2+}}$，乳酸脱氢酶 辅酶 辅酶 I，血红蛋白 辅基 血红素
    • 多肽链 + 其他修饰

  • 蛋白质可大可小。

一级结构 primary structure

也称共价结构，独特的==氨基酸序列==，由基因决定。书写由 N 端到 C 端。

肽键具有部分双键的性质，多为 trans，==X–Pro== 时为 cis (PPI 催化)。与肽键相关的6个原子共处肽平面。

蛋白质的二面角 (dihedral angle)

$\varphi$ 为 $\ce{C_\alpha-N}$ 单键的旋转角度，$\psi$ 为 $\ce{C_\alpha-C}$ 单键的旋转角度。骨架呈 W 形时 $\varphi = \psi = 180\degree$。Ramachandran 作图表示了在侧链残基限制下所有可能存在的 $(\varphi, \psi)$ 取值范围。

二级结构 secondary structure
不同二级结构在 Ramachandran 图中的位置

多肽链的==主链骨架 (backbone) 本身==（不包括R基团）在局部有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。包含：

$\alpha$-螺旋和其他螺旋
  • 第 $n$ 位的羰基 O 与第 $n+4$ 位的氨基 H 形成氢键起稳定作用，封闭的环含 13 个原子
  • 每隔 3.6 残基，螺旋上升一圈
  • 主要是右手螺旋
  • 偶极矩作用
  • Ala 丙, Cys 半胱, Leu 亮, Met 甲硫, Glu 谷, Gln 谷氨酰胺, His 组, Lys 赖
  • 亲水、疏水、两亲：螺旋轮作图
$\beta$-折叠
  • 至少两条肽段，每一条被称为 $\beta$-strand ($\beta$ 股)，相邻肽段平行排列，肽键形成氢键
  • 侧链垂直与两相邻肽平面交线，交替分布在片层两侧
  • 平行/反平行，反平行更稳定（$\ce{N-H-O}$ 几乎处于同一直线）
  • 0.325 nm/aa 平行，0.347nm/aa 反平行
  • $\beta$ 股来源：同肽链不同肽段/不同肽链/不同蛋白质
  • Val, Ile, Phe, Tyr, Trp
$\beta$-转角
  • $180\degree$ 回折，4 个连续的残基，残基 #1 $\ce{C=O…H-N}$ 残基 #4
  • Gly, Pro 常出现
  • 利于反平行 $\beta$ 折叠形成
  • The, Gly, Ser, Asp, Asn, Pro
$\beta$-凸起
  • 在 $\beta$ 折叠的一股中额外插入一个残基
  • 主要在反平行折叠中
环和无规卷曲
三级结构

是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成的包括==所有原子==在内的特定的三维结构。

  • 主要通过氨基酸侧链以次级键（有时还有二硫键和金属配位键）维系
  • 稳定三级结构的作用力主要包括==氢键、离子键、疏水键、范德华力==。

构象 (conformation)：一种蛋白质的全部三维结构。构象的转变是由单键自由旋转造成的。

确定三级结构的方法：
X-射线晶体衍射、核磁共振波谱 (<120 aa)、冷冻电镜、同源建模、机器学习预测

三级结构的结构部件：

模体 motif

  1. 是指在蛋白质或核酸一级结构上，特指具有特殊生化功能的特定氨基酸或碱基序列，因此被称为序列模体 (sequence motif)；

  2. 是指具有特定功能的或作为一个独立结构域一部分的相邻的二级结构的聚合体，一般被称为功能模体 (functional motif) 或 结构模体 (structural motif)，相当于超二级结构 (super-secondary structure)。

常见模体：

  • β 发夹环：两个反平行 β 股由一个环相连
  • β 折叠–α 螺旋–β 折叠，即 βαβ
  • 卷曲螺旋和螺旋束：两个或多个 α 螺旋的聚合体
  • α 螺旋–环–α 螺旋 (EF 手相)，环中通常有 $\ce{Ca^{2+}}$
  • α 螺旋–β 转角–α 螺旋，即 αβα，与 DNA 结合
  • Rossmann 折叠
  • 希腊钥匙
  • β 螺旋
结构域 domain

主要是球状蛋白的一种结构层次。在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块，是由若干个结构模体组成的相对独立的球形结构单位。

  1. α结构域：完全由α螺旋组成

  2. β结构域：只含有β折叠、β转角和不规则环结构

  3. α/β结构域：由β股和起连接的α螺旋片段组成

  4. α+β-结构域：由独立的α螺旋区和β折叠区组成

  5. 交联结构域：缺乏特定的二级结构元件，但由几个二硫键或金属离子起稳定作用

四级结构

具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。不以二硫键（共价键）相连。其内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。

==主要作用力：氢键、疏水键、范德华力、离子键（亚基间作用）==

蛋白质的折叠历程与结构预测

==基本规律==
  1. ==Anfinsen 法则：一级结构决定三级结构。==
  2. 在细胞内，不同的蛋白质可能具有不同的折叠路径，体内绝大多数蛋白质折叠需要分子伴侣的帮助；
  3. 蛋白质的折叠是协同和有序的过程，驱动蛋白质（特别是球状蛋白质）折叠的主要动力是疏水键，其他次级键也有作用；
  4. 蛋白质的折叠伴随着自由能的降低（-20.92kJ/mol ~-83.68kJ/mol），但是蛋白质折叠并不是通过随机尝试找到自由能最低的构象的；
  5. 最终得到的蛋白质构象不是僵硬的，而是具有一定的柔性。
  6. 某些蛋白质折叠还需要蛋白质二硫化物异构酶 (PDI) 和肽酰脯氨酰顺反异构酶 (PPI) 的帮助。
折叠历程
  1. 分子伴侣 molecular chaperone：帮助体内蛋白质折叠的一类蛋白质。
  • 在正确的时间和地点促进正确折叠
  • 帮助错误折叠的蛋白重新折叠成正确的构象

常见：HSP70，伴侣蛋白家族

  • HSP70 通过与部分折叠的蛋白质的疏水区域的临时结合而促进蛋白质的正确折叠。
  • 伴侣蛋白则形成大的桶状结构容纳部分折叠的蛋白质完成折叠。

折叠好立即释放，参与新生蛋白质的折叠。

  1. 滑雪模型

  2. PDI/PPI 辅助二硫化/顺反异构

体外：

  1. 启动—快速地形成局部二级结构，即折叠核。此过程是可逆的；
  2. 折叠核协同聚合成结构域；
  3. 结构域经熔球体，最终形成具有完整三维结构的蛋白质。熔球被认为是疏水塌陷的结果，这样的状态含有某些二级结构，但还没有形成正确的三级结构。
错误折叠相关疾病
  • 海绵状脑病：朊蛋白 (prion protein, PrP^sc^)，催化正常的 PrP^c^ 转变为 PrP^sc^（能抵抗水解）
  • 囊性纤维变性：CFTR 错误折叠导致无法排出细胞内 $\ce{Cl-}$，细胞吸收外环境粘液水分导致粘液变稠阻碍呼吸，反复感染。
结构预测
  • 二级结构：可行。局部结构，明显倾向性。
  • 三级结构：非常困难，已有突破。

蛋白质组及蛋白质组学

  • 蛋白质组 (proteome)：是指某一物种所有基因表达的全部蛋白质及其存在方式，即一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。

  • 蛋白质组学 (proteomics)：是对蛋白质性质和功能的大规模研究，研究不同蛋白质如何相互作用以及它们在生物体内发挥的作用。

  • 主要研究方法：双向电泳和质谱分析

名词解释

  • peptide
    肽
    氨基酸之间发生缩合反应后通过肽键相连的聚合物。

  • peptide plane
    肽平面
    蛋白质分子中与肽键相关的 6 个原子共同组成的平面。

  • ==dihedral angle==
    二面角
    在肽链中与同一个 $\ce{C_\alpha}$ 相连的两个肽平面的旋转角度 $\varphi$ 和 $\psi$。

  • poly-amino acids
    多聚氨基酸

  • amphipathic helix
    两亲螺旋

  • conformation
    构象
    一种蛋白质的全部三维结构。构象转换仅由单键自由旋转造成，不涉及共价键的断裂和形成。

  • configuration
    构型
    立体异构中一组特定的原子或基团在空间上的几何布局。构型转换伴随共价键的断裂和形成。

  • hydrophobic bond
    疏水键
    疏水基团或疏水分子在水溶液里为避开水而相互聚集形成的作用力。

  • motif
    模体

    1. 是指在蛋白质或核酸一级结构上，特指具有特殊生化功能的特定氨基酸或碱基序列，因此被称为序列模体 (sequence motif)；
    2. 是指具有特定功能的或作为一个独立结构域一部分的相邻的二级结构的聚合体，一般被称为功能模体 (functional motif) 或 结构模体 (structural motif)，相当于超二级结构 (super-secondary structure)。

  • domain
    结构域

  • oligomer
    寡聚体
    由一条肽链以上肽链组成的蛋白质称为寡聚体蛋白。

  • proteome
    蛋白质组
    某一物种所有基因表达的全部蛋白质及其存在方式。

第 3 章 蛋白质的功能及其与结构之间的关系

知识概要

==蛋白质的功能==

生物功能试剂
  • 生物催化剂：酶 e.g. 核糖核酸酶
  • 信号转导 e.g. 胰岛素及其受体
  • 基因表达调控 e.g. 转录因子
  • 免疫 e.g. 抗体
  • 运输和贮存 e.g. Hb, Mb
  • 结构支持 e.g. 毛发、胶原
  • 运动 e.g. 肌动蛋白、肌球蛋白
  • 奇异功能 e.g. 南极鱼的抗冷冻蛋白
==兼职蛋白 moonlighting proteins==

兼有几种甚至多种不同功能的蛋白质。

e.g. 3-磷酸甘油醛脱氢酶：

  • 糖酵解 四聚体 细胞质
  • 尿嘧啶-DNA 糖苷酶 单体 细胞核 DNA 碱基切除修复

==蛋白质结构与功能之间的关系==

基本规则
  1. 蛋白质的==一级结构决定其三维结构==，==三维结构直接决定蛋白质的功能==。
  2. 大多数蛋白合成后就会折叠成特定的三维结构，行使特定的生物学功能。一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。
  3. 蛋白质在行使功能的时候一般需要三维结构或构象的变化。
  4. 结构相似的蛋白质一般具有相似的功能。
  5. 功能相似的蛋白具有相同或基本相同的三维结构，一级结构的差异往往能显示它们在进化上的亲缘关系，这是研究分子进化的基础。
  6. 一级结构相似的蛋白质往往具有共同的起源。
  7. 许多疾病是蛋白质结构异常引起，属于构象病。

e.g. 细胞色素 c

蛋白质进化的两种情形
  • 类似物 analog：具有相同功能，但起源于不同祖先基因的蛋白质。趋同进化 (convergent evolution) 产物。
  • 同源物 homolog：存在于不同生物/同种生物，来源于某一共同祖先基因的蛋白质。
    • 种间同源物 ortholog：来自于不同物种的由垂直家系进化而来的蛋白质，通常保留与原始蛋白相同的功能（也不尽然）。
    • 种内同源物 paralog：旁系同源物，同一物种内由于基因复制、分离产生的同源物。
几种重要蛋白质的结构与功能
纤维状蛋白 fibrous protein

  • *α 角蛋白 * 头发

    一级结构 311~314 aa

    二级结构 中央形成典型 α 螺旋，两端非螺旋区。

    螺旋区由七肽重复序列 $\ce{(\bond{-}a\bond{-}b\bond{-}c\bond{-}d\bond{-}e\bond{-}f\bond{-}g)_n}$ 组成，其中 a, d 为疏水氨基酸，使得两个 α 角蛋白分子能通过 a, d 的疏水基团结合，相互缠绕形成双股左手超螺旋，即卷曲螺旋。

    链间多个 $\ce{-S-S\bond{-}}$ 进一步提高 α 角蛋白的强度。

  • β 角蛋白 蛛丝

    一级结构 富含 Ala 丙 和 Gly 甘，具有重复序列 Gly-Ala/Ser-Gly-Ala/Ser

    二级结构 主要是有序的反平行 β 折叠，还有一些无序 α 螺旋和 β 转角环绕在其周围。Gly 和 Ala/Ser 分别分布于折叠片层的两侧，使得相邻的 β 折叠更加紧密地堆积形成网状结构，从而赋予丝较高的抗张性能。同时 α 螺旋又使蛛丝具有一定的柔软性。

  • 胶原蛋白

    胶原蛋白的基本组成单位是由 3 条 α 链组成的原胶原分子。

    一级结构 ~ 1/3 Gly, ~ 12% Pro，三种羟基化的 Pro 和 Lys

    每条肽链具有重复的 $\ce{Gly-Pro/Lys-Pro/Lys}$ 三联体序列，难以形成 α 螺旋和 β 折叠。

    ==有利于形成原胶原特有二级结构——三股螺旋 (triple helix)。==

    羟基化为了弥补 Pro 亚氨基形成肽键后造成氢键供体不足。羟基化需要维生素 C。缺乏维生素 C 引起坏血病。

球状蛋白 globular protein

珠蛋白家族 (globin family) 均含有血红素辅基 (heme)，能可逆结合氧气，含有珠蛋白折叠结构模体。有 Mb, Hb, Ngb, Cygb。

  • 肌红蛋白 Mb

    一级结构 一条肽链，紧密结合一个 heme

    二级结构 共有 8 段 α 螺旋

    三级结构 1959。获得

    疏水口袋，heme Fe^2+^ 与 His F8 (近端, proximal) 结合藏在洞中， ==His E7 (远端, distal) 防止 Fe^2+^ 被氧化。==

  • 血红蛋白 Hb

    ==四个亚基 (α1, β1 α2, β2)，具有四级结构。==每一个亚基称为珠蛋白，单个亚基一级结构与 Mb 相差较大，但二级、三级结构相似。

    • 正协同效应
      一个亚基结合 $\ce{O2}$ 后构象变化，使其他亚基对 $\ce{O2}$ 的亲和力突然增强，造成氧合曲线呈 S 形。解释：序变、齐变。==T 态：低亲和，R 态：高亲和。==

    • 波尔效应
      $\ce{H+}$ 和 $\ce{CO2}$ 促进 Hb 释放 $\ce{O2}$ 的现象。原因是 $\ce{H+}$ 和 $\ce{CO2}$ 能与 Hb 特定位点结合，促进 Hb 由 R 态 转为 T 态。$\ce{CO2}$ 可以通过水溶解离产生 $\ce{H+}$ 和自身与亚基产生可逆反应（一种别构效应）两种途径产生波尔效应。

    • 别构效应
      除 $\ce{O2}$ 以外的各种配体在血红素铁以外的位点与 Hb 结合，导致 Hb 的构象发生变化，进而影响到 Hb 氧合能力的现象。e.g. 2,3–BPG 与两条 β 链结合导致由 R 态转为 T 态。

      分子水平的母爱：HbF 对 $\ce{O2}$ 的亲和力明显高于 HbA，有利于胎儿从母亲胎盘获取氧气。原因是 HbF 亚基为 α2γ2，无法结合 BPG。

膜蛋白 membrane protein
天然无折叠蛋白质 NUP

生理条件下，缺乏特定的二级结构和三级结构，处于完全无折叠或部分无折叠状态，但仍然具有功能的一类蛋白质。

  • 完全无折叠 (~10%)/部分无折叠 (无折叠区域 > 50 aa)
  • 一般含有较多 Gln, Ser, Pro, Glu, Lys，且侧链较大的疏水氨基酸很少。
  • 信号转导、细胞周期调控、基因表达调控、翻译后加工、RNA/蛋白质分子伴侣
  • 必须处在无折叠状态/与特定配体结合折叠行使功能

蛋白质功能预测

  1. 基于序列
  2. 基于结构
  3. 结构/序列比对
  4. 基于模体
  5. 基于“连坐”

名词解释

  • moonlighting protein
    兼职蛋白
    兼有多种功能的蛋白质。
  • analog
    类似物
    具有相同功能，但起源于不同祖先基因的蛋白质。趋同进化 (convergent evolution) 产物。
  • homolog
    同源物
    存在于不同生物/同种生物，来源于某一共同祖先基因的蛋白质。
  • ortholog
    种间同源物
    来自于不同物种的由垂直家系进化而来的蛋白质，通常保留与原始蛋白相同的功能。
  • paralog
    种内同源物
    又名旁系同源物，同一物种内由于基因复制、分离产生的同源物。

第 4 章 蛋白质的理化性质、分类及研究方法

知识概要

==蛋白质的理化性质==

  • 紫外吸收：最大吸收峰为 280 nm
  • 两性解离及 pI：pI 不能直接计算，只能使用 等电聚焦 或 等电点沉淀 等方法进行测定
  • 胶体性质
  • 沉淀反应：盐析（硫酸铵最常用）、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀
  • ==变性==、复性
  • 水解
  • 颜色反应
变性 denaturation

蛋白质受到某些理化因素的作用，其特有的三维结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。

物理因素：加热、冷却、机械作用、流体压力、辐射
化学因素：强酸强碱、高浓度盐、==尿素==、重金属盐、疏水分子、有机溶剂

主要理化性质变化：(1) 生物活性丧失 (2) 水溶性下降 (3) 更容易被水解 (4) 黏度增加 (5) 失去结晶能力

水解

蛋白质在强酸、强碱并加热条件或蛋白酶的催化下均能够发生水解。

  • 酸水解破坏 Trp 和三种羟基氨基酸，将 Gln, Asn 水解为 Glu, Asp

  • 碱水解破坏多数氨基酸，产生消旋现象，但不破坏 Trp

  • 酶水解效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但不同蛋白酶对肽键特异性不同

      graph LR
    蛋白酶 --- 内切蛋白酶
    蛋白酶 --- 外切蛋白酶
  外切蛋白酶 --- 氨肽酶
  外切蛋白酶 --- 羧肽酶
    蛋白酶 特异性
    羧肽酶 A C 端==除 R, K, P== 以外的氨基酸
    羧肽酶 B C 端只能是 ==R, K==
    胰蛋白酶（内切） 任何与 ==R 和 K 羧基==形成的肽键
    胰凝乳蛋白酶（内切） 任何与 ==F, W 和 Y 羧基==形成的肽键（除 P）
    胃蛋白酶 任何与 ==L, F, W, Y 氨基==形成的肽键（除 P）

蛋白质的研究方法

蛋白质的纯化
  • 准备工作：目的、测活方法、原料
  • 纯化步骤：
    1. 破碎 混合和匀浆
    2. 除渣 离心
    3. 沉淀/浓缩 硫酸铵/乙二醇
    4. 纯化 层析
    5. 鉴定
蛋白质一级结构的测定
  • 直接测定：化学测定/质谱
  • 间接测定：基因序列 → 氨基酸序列

名词解释

  • salting out
    盐析
    在蛋白质溶液中加入一定量中性盐使蛋白质溶解度降低析出的现象。

  • denaturation
    变性
    蛋白质受到某些理化因素的作用，其特有的三维结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。

第 5 章 核苷酸

知识概要

==核苷酸的结构与组成==

==碱基 nitrogenous base==
  • 嘧啶 (pyrimidine) 碱基
    • 胞嘧啶 Cytosine
    • 尿嘧啶 Uracil (RNA)
    • 胸腺嘧啶 Thymine
  • 嘌呤 (purine) 碱基
    • 腺嘌呤 Adenine
    • 鸟嘌呤 Guanine

甲基化——表观遗传、基因表达调控

核苷 nucleoside
  • 核苷是由戊糖和碱基通过 β-N-糖苷键形成的糖苷。
  • 核苷中的戊糖有 D-核糖 和 2-脱氧-D-核糖 两种，它们都以呋喃型环状结构存在。
  • D-核糖 → RNA，2-脱氧-D-核糖 → DNA，影响二级结构、稳定性。
核苷的构象

核苷和核苷酸能以 cis/trans 存在。嘧啶核苷通常为 trans；自由的嘌呤核苷易形成 cis，但 DNA 和 RNA 螺旋中的嘌呤核苷主要为 trans。

核苷酸 nucleotide
  • 核苷酸是核苷的戊糖 羟基 发生磷酸化反应而形成的磷酸酯。
  • 核糖核苷的磷酸酯为核糖核苷酸，脱氧核苷的磷酸酯为脱氧核苷酸。
  • 自然界的核苷酸多为核苷-5′-磷酸。
核苷单磷酸 (NMP)、核苷二磷酸 (NDP) 和核苷三磷酸 (NTP)
  • NMP 是指核苷的单磷酸酯。
  • 核苷单磷酸可以通过一次成酐反应形成 NDP。核苷二磷酸再通过一次成酐反应生成 NTP。

核苷酸的生物学功能

  1. 核酸合成的前体：NTP → RNA，dNTP → DNA；
  2. 能量货币，ATP 是细胞最为通用的，有时使用 UTP (糖原合成)、CTP (磷脂合成) 和GTP (蛋白质合成)；
  3. 信号转导，例如 cAMP 和 cGMP 作为某些激素的第二信使，鸟苷酸能够调节 G 蛋白的活性；
  4. 作为其他物质的前体或辅酶/辅基的成分，如 ADP 为辅酶 I 和 II 的组分，鸟苷酸作为第一类内含子的辅酶；
  5. 活化的中间物，如 UDPGlc 和 CDP-乙醇胺分别参与糖原和磷脂酰乙醇胺的合成；
  6. 作为酶的别构效应物参与代谢的调节，如 ATP 为磷酸果糖激酶-1 的负别构效应物，AMP 作为糖原磷酸化酶的正别构效应物；
  7. 调节基因表达。例如 ppGpp 和 pppGpp 参与调节原核细胞蛋白质的合成。

第 6 章 核酸的结构与功能

知识概要

==核酸的分类==

多个核苷酸通过 3’, 5’-磷酸二酯键相连，形成 RNA 或 DNA。

RNA 通常单链，DNA 通常双链的原因

RNA处于单链状态可以自我折叠，形成二级结构和三级结构，这是形成 RNA 结构多样性的基础，使其在细胞内行使多项生物学功能。DNA 双链使其能充分行使作为遗传物质这项唯一功能。

==DNA 的第四个碱基通常是 T 的原因==

C 自发脱氨基变为 U，通过引入 T 来识别正常的 U 和突变的 U。

==核酸的一级结构==

  • 核苷酸/碱基的排列顺序
  • 从 5’ 到 3’ 书写
  • DNA 一级结构贮存各种遗传信息
  • 3’, 5’-磷酸二酯键
  • 直接/间接测定

==核酸的高级结构==

==DNA 的二级结构==

DNA 的二级结构主要是各种形式的螺旋，特别是 B-型双螺旋，此外还有 A-型双螺旋、Z-型双螺旋等。

B-型双螺旋

Watson and Crick, 1953.

  1. 反平行双链，互相缠绕形成右手双螺旋
  2. A–T, G–C 互补双链
  3. 碱基对位于双螺旋内部，垂直于螺旋轴；脱氧核糖–磷酸骨架位于表面
  4. 大小沟

==碱基堆积力==：碱基对在垂直方向相互作用所产生的力。==化学本质是碱基对之间的疏水键和范德华力。==

==双螺旋稳定的因素==：氢键、==碱基堆积力==、阳离子/带正电荷化合物对磷酸基团的中和。

==DNA 的非标准二级结构==

特殊条件下形成其他非标准的二级结构。弯曲/十字形/三螺旋 H-DNA/碱基翻转/四链螺旋与 G-四联体/滑动错配
特殊条件：DNA 受到某些蛋白质的作用（如组蛋白）；DNA 本身所具有的特殊基序模体。

==DNA 的三级结构——超螺旋==

如果通过某种手段使得DNA双螺旋每一圈的碱基对数目多于或少于10对，将导致DNA双螺旋过度缠绕或缠绕不足；如果这时的DNA两端被固定或者DNA本来是共价闭环的，则DNA会因张力无法释放而自发地形成超螺旋结构。

  • 正超螺旋：左手超螺旋，过度缠绕引起
  • 负超螺旋：右手超螺旋，缠绕不足引起
RNA 的二级结构

主要取决于碱基组成。多数 RNA 仅由一条链组成，经自我折叠形成二级结构。不同区段互补序列间形成局部 A-型双螺旋，非互补碱基则游离在双螺旋外形成各种二级结构。少数病毒的基因组 RNA 由两条互补的链组成 A-型双螺旋。在 RNA 双螺旋内常发现 G–U 碱基对。

  • 发夹结构
RNA 的三级结构

在二级结构基础上进一步折叠包装而成。

主要结构模体：pseudo-knot, kissing hairpin, tRNA 的倒 L 型三级结构。

tRNA：氨基酸的运载工具
  • 单链，73~94 核苷酸，不少经过修饰
  • 3’ 端最后三个总为 CCA，链内大多数碱基通过氢键相连。但几乎所有 tRNA 上不变的核苷酸都在三叶草结构上非氢键区域。
  • 二级结构要素：环、茎、臂。三叶草结构，四环四茎。
  • 三级结构形成原因：D 环上的碱基与不变碱基以及 TψC 环上的碱基之间的发生的氢键作用将 D 臂和 TψC 臂折叠到一起，并将三叶草二级结构弯曲成稳定的倒 L 型三级结构。

核酸的功能

DNA
主要遗传物质

RNA
病毒遗传物质、核酶、蛋白质生物合成、引物、RNA 前体后加工、基因表达调控、蛋白质共翻译定向分拣、X 染色体失活

第 7 章 核酸的理化性质及研究方法

知识概要

==核酸的理化性质==

  • 紫外吸收 260 nm
  • 酸碱解离
  • 黏度
  • 沉淀（无水乙醇）
  • ==变性==、复性、杂交
  • 水解
变性 denaturation

核酸的变性是指在特定因素（如加热、碱性 pH 或低离子强度等或特殊的化学试剂的作用）作用下，其双螺旋区因氢键和碱基堆积力的破坏而发生解链的过程。其中并不涉及共价键断裂。

表征：

  • ==紫外吸收升高==：增色效应 hyperchromic effect
  • 浮力密度升高
  • 黏度降低
  • 生物学功能不变/丧失

==$T_\text m$==：半数氢键受到破坏时的温度，DNA 的“熔点”。受到 DNA 均一性、G–C 含量、离子强度、双螺旋长度和特殊化学试剂的影响。

复性 renaturation

当各种变性因素不复存在的时候，变性时解开的互补单链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性。热变性 DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过程被称为退火 (annealing)。

表征与变性相反：

  • ==紫外吸收减少==：减色效应 hypochromic effect
  • 浮力密度降低
  • 黏度升高
  • 生物活性恢复

影响因素：温度、离子强度、DNA 浓度、DNA 序列复杂度。

核酸的水解
  • 酸水解
    糖苷键/磷酸二酯键对酸的敏感性不同。糖苷键 > 磷酸二酯键；嘌呤糖苷键 > 嘧啶糖苷键。
  • 碱水解
    RNA 的磷酸二酯键对碱异常敏感，得到 2’- 或 3’- 核苷酸的混合物；DNA 对碱的作用不敏感。生理意义是 DNA 作为遗传物质应当更稳定，而 RNA（尤其是 mRNA）是 DNA 的信使，完成任务后应当迅速降解。
  • 酶促水解
    RNAse H 内切与 DNA 杂交的 RNA, 核酸酶 S1 内切单链 DNA 或 RNA。
核酸的分离、纯化和定量
  • 抽取
    1. 两种核蛋白的分离
    2. 蛋白质的去除
    3. 核酸的沉淀
  • 电泳
  • 离心
  • 层析
  • 纯度检测和定量
DNA 一级结构的测定
  • 末端终止法/双脱氧法
    原理：ddNTP 参入可导致 DNA 复制的末端终止。
  • 化学断裂法
    原理：用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素 (^32^P) 标记的单链 DNA 或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链 DNA 片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的 DNA 链降解产物，经聚丙烯凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测 DNA 片段的核苷酸序列。
  • 焦磷酸测序
    在同一反应体系中发生由 4 种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种 dNTP，若该 dNTP 与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的 3′-端并释放出等量 PPi。PPi 可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种 dNTP，继续下一轮 DNA 链的合成。
  • 深度测序
RNA 一级结构的测定
  • 逆转录为 cDNA
  • 化学 &/ 酶学方法对放射性同位素标记的 RNA 部分消化后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
  • 质谱法

名词解释

  • hyperchromic effect
    增色效应
    核酸变性时紫外吸收增强的现象。

  • hypochromic effect
    减色效应
    核酸复性时紫外吸收减弱的现象。

  • annealing
    退火
    热变性 DNA 经缓慢冷却后复性的过程。

  • nucleation
    成核作用
    两个互补单链分子间的接触以启动部分互补碱基的配对，是 DNA 复性的第一步。

第 8 章 酶学概论

知识概要

酶的定义与化学本质

定义：酶是由细胞合成、在机体内行使催化功能的生物催化剂 (biocatalyst)。

酶的化学本质
  • 主要是蛋白质，极少数是 RNA。
  • 具有催化活性的 RNA 被称为核酶 (riboenzyme)。

酶的催化性质

酶促反应与非酶促反应的不同性质
  • 酶促反应的速率高很多
  • 酶促反应呈现饱和动力学
  • 酶促反应有最适温度和最适 pH
酶与非酶催化剂的共同性质
  • 只能催化热力学允许的反应
  • 反应完成后本身不被消耗或变化，可重复利用
  • 对正反应和逆反应的催化作用相同
  • 不改变平衡常数，只改变反应速率
==酶特有的催化性质==
  • 高效性

    酶比无机催化剂高效 10^6^ ~ 10^12^ 倍。

  • 在活性中心与底物结合

    活性中心 (active site)：酶分子上与底物结合并与催化作用直接相关的区域。

    • 结合基团 + 催化基团
    • 三维实体，通常由在一级结构上并不相邻的氨基酸残基组成
    • 只占酶总体积的很小一部分
    • 中心多为疏水氨基酸残基，也有少量亲水氨基酸残基供底物结合和催化
    • 与底物结合为多重次级键，包括氢键、疏水键和范德华力
    • 专一性在一定程度上取决于活性中心与底物在结构上的互补性
    • 构象并非固定，具有一定柔性
  • 专一性
    • 绝对专一性
      一种酶仅催化一个特定的反应，对底物有非常严格的要求。
    • 相对专一性
      基团专一性/键专一性
    • 立体专一性
      对具有立体异构体的底物只作用于其中的一种，而对另一种无效的性质。

    解释专一性的三种模型：

    • 锁–钥匙 Lock & Key
    • 诱导契合 Induced Fit
    • 三点附着 Three-point Attachment（立体专一性）
  • 反应条件温和
  • 对反应条件敏感、易失活
  • 受调控
  • 许多酶的活性需要辅助因子（多为维生素及其衍生物）

酶的分类和命名

根据化学组成：

  • 单纯酶
  • 缀合酶/结合酶
    • 多肽链 + 辅因子 (cofactor)
    • RNA + 金属离子/蛋白质

根据结构特征：单体酶/寡聚酶/多酶复合物

缀合酶

辅因子 (cofactor)：缀合酶除了多肽链外，结合的某些对热稳定的非蛋白质小分子或金属离子。丧失辅因子的酶被称为脱辅酶 (apoenzyme)，与辅因子结合在一起的酶被称为全酶 (holoenzyme)。包含：

  • 辅酶 (coenzyme)：与脱辅酶结合松散、使用透析或超滤等温和的方法就容易去除的有机小分子。
  • 辅基 (prosthetic group)：与脱辅酶结合紧密、使用透析或超滤的方法难以去除的有机小分子。
  • 和金属离子。

名词解释

  • active site
    活性中心
    酶分子上与底物结合并与催化作用直接相关的区域。
  • cofactor
    辅因子
  • coenzyme
    辅酶
  • prosthetic group
    辅基

第 9 章 酶动力学

知识概要

什么是酶动力学

酶动力学 (enzyme kinetics) 是研究酶促反应影响因素及其变化规律的一门学科。

影响酶促反应的因素

  • 外因：温度、pH、离子强度、抑制剂/激活剂
  • 内因：酶浓度、底物浓度

==米氏酶动力学==

对于一个单底物-单产物的反应可建立 Michaelis-Menten 模型：$\ce{E + S <=>[$k_1$][$k_{-1}$] ES ->[$k_2$] E + P}$，有米氏方程：
$$
% \left[\text{ES}\right] = \frac{\left[\text E_t\right]\left[\text S\right]}{\left[\text S \right] + K_\text m}\
% v = \frac{k_2\left[\text E_t\right]\left[\text S\right]}{\left[\text S \right] + K_\text m}\
% \left[\text S\right] \to \infty \ 时有\ v = k_2 \left[\text E_t \right] = V_\text{max}\
v = \frac{V_\text{max}\left[\text S\right]}{\left[\text S \right] + K_\text m}
$$
方程成立需满足 3 个条件：

  • 反应速率为初速率， 此时反应速率与酶浓度成正比
  • 酶–底物复合物处于稳态，即 ES 浓度不发生变化
  • 符合质量作用定律，即反应速率与底物浓度成正比
米氏方程的解读

  1. 米氏常数 $K_\text m$

    • 米氏酶的特征常数，一定条件下可表示酶与底物的亲和力。越大则亲和力越低，越小则亲和力越高。
    • ==$K_\text m$ 是酶反应初速率为 $V_\text{max}$ 一半时底物的浓度。==
    • 可帮助判断可逆反应方向，若对底物的 $K_\text m$ 小于对产物的，则有利于正反应（反之则有利于逆反应）。

  2. $V_\text{max}$

    也是酶的特征常数，但随酶浓度变化而变化。

  3. ==$k_\text{cat}$==

    • 催化常数/转换数/周转数 (turnover number)
    • 单位时间内一个酶分子将底物转变为产物的分子总数。
    • 单位是 时间的倒数 (e.g. s^-1^)。对于遵守米氏方程的酶有 $k_\text{cat} = k_2 = \frac{V_\text{max}}{\text E_t}$。

  4. $\frac{k_\text{cat}}{K_\text m}$

    可用于衡量催化效率（越大越好），反映一个酶的完美程度，寻找最佳底物。

米氏方程的双重性
  • 底物浓度很低时有 $v = \frac{V_\text{max}\left[\text S\right]}{\left[\text S \right] + K_\text m} = \frac{V_\text{max}\left[\text S\right]}{K_\text m}$，此时反应速率与底物浓度成正比，符合一级动力学；
  • 底物浓度很高时有 $v = \frac{V_\text{max}\left[\text S\right]}{\left[\text S \right] + K_\text m} = \frac{V_\text{max}\left[\text S\right]}{\left[\text S\right]} = V_\text{max}$，此时酶反应速率接近最大值，继续增加底物浓度反应速率也不会继续增加，符合零级动力学。
米氏方程的线性转换

双倒数作图/Eadie-Hofstee 作图/Hanes-Wolff 作图

==米氏酶抑制剂作用的动力学==

酶抑制剂 (inhibitor)：通过与酶分子结合而降低反应速率、抑制酶活性的物质。

  • 可逆性抑制剂
    以非共价键与酶可逆结合，使用透析/超滤就可去除，使酶恢复活性。
    • 竞争性抑制剂
      一类与底物相似，另一类不相似。
      动力学：$K_\text m$ 提高，$V_\text{max}$ 不变。
    • 非竞争性抑制剂
      既与 ES 结合，又与游离的酶结合。一旦与酶结合，将导致活性受到抑制。
      动力学：$K_\text{m}$ 不变，$V_\text{max}$ 降低。
    • 反竞争性抑制剂
      只能与 ES 结合，但不能与游离的酶结合。一旦与 ES 结合，将导致不能转变成产物。
      动力学：$K_\text{m}$ 降低，$V_\text{max}$ 降低。
  • 不可逆性抑制剂
    以强化学键（通常是共价键）与酶不可逆结合，导致酶的有效浓度降低，一旦失活就不可逆转。
    • 基因特异性抑制剂
      与底物不相似，但能共价修饰活性中心必需的侧链基团。
    • 底物类似物抑制剂
      结构上类似底物，在活性中心与酶结合，不可逆修饰活性中心必需基团。
    • 过渡态类似物抑制剂
      与过渡态相似，在结构和形状上与酶的活性中心非常匹配，能以极高的亲和力与活性中心结合，导致底物无法进入。
    • 自杀型抑制剂
      在与酶结合后受酶催化发生反应但不形成产物，转而修饰酶的必需基团。（酶自杀了）

==别构酶的动力学==

别构酶除了活性中心，还有别构中心 (allosteric site)。

别构效应物
  • 可逆：非共价结合
  • 不可逆：限制反应速率
别构酶的性质
  • 动力学曲线一般为 S 型
  • 具有别构效应物（别构调节）
  • 对竞争性抑制作用表现双相应答
  • 温和变性可导致别构效应丧失
  • 通常是寡聚酶
  • 与非别构酶相比较少
协同性

==Hill 方程==能够很好地说明别构酶的 S 型曲线动力学：
$$
v = \frac{V_\text{max} \cdot \left[\text S \right]^h}{K_{0.5}^h + \left[\text S \right]^h}
$$
其中 $h$ 为 Hill 系数，$h=1$ 无协同效应（米氏酶），$h > 1$ 有正协同性，$h < 1$ 有负协同效应。

正协同性意味着酶对底物浓度变化更加敏感，负协同性则反之，保证反应不受底物浓度影响持续进行。

名词解释

  • turnover number
    周转数
    单个酶分子在单位时间内催化底物转变为产物的分子个数。
  • allosteric effect
    别构效应
    别构物结合酶的非活性点位引起酶构象发生变化，从而使酶的活性发生改变的现象。

第 10 章 酶的催化机制

知识概要

酶催化机制的主要研究方法

找出保守性的氨基酸残基/三维结构的研究/定点突变/动力学分析/化学修饰/计算机模拟

==过渡态稳定学说==

过渡态 (transition state)：在任何一个化学反应体系中，反应物需要到达一个特定的高能状态以后才能发生反应。这种不稳定的高能状态就是过渡态。

过渡态互补示意图

==过渡态稳定的化学机制==

与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和反应性以及活性中心与结合底物之间的相互作用的必然结果。酶充分使用一系列的化学机制来实现过渡态的稳定并由此加速反应。

邻近定向效应 catalysis by proximity and orientation

两种或两种以上 的底物同时结合在一个酶活性中心上，相互靠近 (邻近)，并采取正确的空间取向(定向)的过程。

  • 提高了底物的有效浓度
  • 将分子间反应转化为近似分子内反应
广义酸碱催化 general acid-base catalysis

酶活性中心的催化基团作为质子供体或受体参与催化，这种机制参与绝大多数酶的催化。

静电催化 electrostatic catalysis

酶利用活性中心电荷的分布来稳定酶促反应的过渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为静电催化。

有时，酶通过与底物的静电作用将底物引入到活性中心。

金属催化 metal catalysis

近三分之一酶的活性需要金属离子的存在

  • 金属酶，含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如 $\ce{Fe^{2+}}$、$\ce{Fe^{3+}}$、$\ce{Cu^{2+}}$、$\ce{Zn^{2+}}$、$\ce{Mn^{2+}}$ 或 $\ce{Co^{3+}}$
  • 金属激活酶，与溶液中的金属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如 $\ce{Na+}$、$\ce{K+}$、$\ce{Mg^{2+}}$ 或 $\ce{Ca^2+}$

金属离子以 5 种方式参与催化：

  1. 作为 Lewis 酸起作用
  2. 与底物结合，促进底物在反应中正确定向
  3. 参与静电催化，稳定带负电荷的过渡态
  4. 通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与氧化还原反应
  5. 作为酶结构的一部分
共价催化 covalent catalysis

酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种催化方式。

  • 两次进攻；共价中间物的形成改变了反应路径，有利于克服活化能能障
  • 主要是亲核催化，也可以是亲电催化
底物形变 substrate strain

当酶与底物相遇时，酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子张力”发生形变，从而更接近它的过渡态的过程。

几种常见酶的结构与功能

==蛋白酶== protease

催化肽键水解的一类酶的总称。

蛋白酶的分类

根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可分为四类：

  • ==丝氨酸蛋白酶==
    此类蛋白酶的催化基团包括 1 个不可缺少的 Ser 残基，DIPF 是它们的不可逆抑制剂；
  • 金属蛋白酶
    这类蛋白酶在活性中心结合有金属离子，其活性绝对需要金属离子，故金属离子螯合剂可导致活性的丧失；
  • 天冬氨酸蛋白酶
    羧基蛋白酶，其催化基团包括 2 个 Asp，在偏碱性的 pH 下无活性；
  • 巯基蛋白酶
    半胱氨酸蛋白酶，其催化基团包括 1 个 Cys 的巯基，碘代乙酸为它们的不可逆抑制剂。
蛋白酶催化的共同性质

所有蛋白酶在催化中都经历碳四面体的过渡态 (Tetrahedral intermediate)，该过渡态的形成涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。

  • 丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶：Ser ($\ce{-OH}$), Cys ($\ce{-SH}$)
  • 其它蛋白酶：水分子
==丝氨酸蛋白酶==

这类蛋白酶以一个特定的 Ser 残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶等。

具有独特的稳定过渡态机制：

  • 共价催化、广义酸碱催化
    催化三元体 (catalytic triad)，由 Ser, His, Asp 残基构成。
  • 氧阴离子穴

不同的丝氨酸蛋白酶对底物有不同的专一性，还具有缓慢的酯酶活性。

溶菌酶 lysozyme

通过水解细菌细胞壁上的肽聚糖使细菌裂解于渗透压的酶。

名词解释

  • transition state
    过渡态
    在任何一个化学反应体系中，反应物需要到达一个特定的高能状态以后才能发生反应。这种不稳定的高能状态就是过渡态。
  • catalysis by proximity and orientation
    [邻近定向效应](#邻近定向效应 catalysis by proximity and orientation)
    两种或两种以上 的底物同时结合在一个酶活性中心上，相互靠近 (邻近)，并采取正确的空间取向(定向)的过程。
  • general acid-base catalysis
    [广义酸碱催化](#广义酸碱催化 general acid-base catalysis)
    酶活性中心的催化基团作为质子供体或受体参与催化的过程。
  • electrostatic catalysis
    [静电催化](#静电催化 electrostatic catalysis)
    酶利用活性中心电荷的分布来稳定酶促反应的过渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化。
  • metal catalysis
    [金属催化](#金属催化 metal catalysis)
  • covalent catalysis
    [共价催化](#共价催化 covalent catalysis)
    酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种催化方式。
  • substrate strain
    [底物形变](#底物形变 substrate strain)
    酶与底物相遇时，酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子张力”发生形变，从而更接近它的过渡态的过程。

第 12 章 酶活性的调节

知识概要

酶的量变

量变：酶的浓度发生变化。方式有以下两种：

  • 同工酶 isozyme
    催化相同的反应，但结构上有所不同的酶 (理化性质 &/ 动力学行为不同)。
  • 酶的合成和降解

==酶的质变==

==别构调节==

别构酶除了活性中心以外还有别构中心 (allosteric site)；能进行别构调节的酶为别构酶。与别构中心结合，调节酶活性的配体分子称为别构效应物。别构调节出现在代谢途径中：

  • 反馈抑制 (feedback inhibition)
    别构调节最多出现的情况。终产物作为别构抑制剂，抑制上游限速酶的活性，从而关闭自身合成的调节方式，称为终产物抑制。
  • 前馈激活 (feed-forward activation)
  • 底物激活 (substrate activation)
    由底物作为别构效应物产生的别构效应称为同促效应 (homotropic effect)，否则称为异促效应 (heterotropic effect)。

许多别构酶具有多个别构中心，能与不同的别构效应物结合。

解释别构效应和协同效应的模型

[Hb 的别构效应](#球状蛋白 globular protein)，T 态、R 态。

  • 齐变模型 (MWC 模型)
    在一个特定的酶分子内部，构成亚基间的相互作用致使每一个亚基都在某时刻采取同一构象，要么都为 T 态，要么都为 R 态。在溶液中两种构象可以互相转变，并处于动态平衡中，但转变方式为齐变。

  • 序变模型 (KNF 模型)
    同一酶分子既有 R 亚基又有 T 亚基，溶液中的 R 态酶与 T 态酶之间存在多种混合体，各种状态的酶处于动态平衡中。
    诱导契合致使与底物结合的亚基由 T 态转换为 R。态。相邻亚基之间存在相互作用，并且这种相互作用可以影响到其他亚基的构象状态。

==共价修饰调节==

酶活性因分子内某些氨基酸残基发生共价修饰而发生变化的过程。

  • 比别构调节慢
  • 修饰方式：磷酸化（最常见）、腺苷酸化、尿苷酸化、ADP–核糖基化、甲基化
水解激活

一些蛋白酶以无活性的酶原 (zymogen) 形式被合成，水解去除一些氨基酸序列后才能激活。不可逆。

调节蛋白的激活或抑制

某些蛋白质能够作为配体与特定的酶结合而调节被结合酶的活性，这些调节酶活性的蛋白质称为调节蛋白。

  • 激活蛋白
  • 抑制蛋白
    通常在活性中心阻止酶与底物结合达到抑制效果。
    e.g. 丝氨酸蛋白酶抑制剂 (SerPIns) 抑制丝氨酸蛋白酶，周期蛋白激活 CDKs。
聚合和解离

e.g. 乙酰 CoA 羧化酶的聚合与解离。

名词解释

  • isozyme
    同工酶
    功能相同但结构有所不同（理化性质 &/ 动力学表现）的酶。

第 14 章 维生素与辅酶

知识概要

维生素 (vitamin)：维持生物体正常生命活动必不可少的一类小分子有机化合物，机体需求量甚少，但不能在体内合成（或者合成的量不能满足机体需要），必须从食物中获取。

维生素前体：可转变为有活性的维生素。

graph TB
    vit[维生素] === ws[水溶性维生素]
    vit === fs[脂溶性维生素]

    ws --- B(维生素 B 族)
    ws --- C(维生素 C)

    fs --- D(维生素 D)
  fs --- A(维生素 A)
  fs --- K(维生素 K)
  fs --- E(维生素 E)

第 15 章 糖类

知识概要

糖类也称碳水化合物，是指多羟基醛或多羟基酮以及它们的缩合物和某些衍生物。

  • 含有醛基的称为全糖，含有羰基的称为酮糖。
  • 根据聚合度的不同可分为单糖、寡糖和多糖。

==单糖==

单糖：最简单的糖类，不能再水解成更简单的单位。根据碳原子数可以分为丙、丁、戊、己、庚糖。根据单糖的化学结构，丙糖以外的单糖可看作是丙糖的衍生体：醛醣衍生于甘油醛，酮糖衍生于二羟丙酮。

单糖的旋光异构

最简单的单糖是丙糖，包括甘油醛和二羟丙酮。其中，甘油醛有一个手性碳原子，具有对映异构体。在各单糖的 Fischer 投影结构式中，将编号最高的手性碳与甘油醛上的进行比较，与 D-型一致的为 D-单糖，反之为 L-单糖。

  • 对映异构体：在各种旋光异构体中互为镜像的一对。
  • 非对映异构体：旋光异构体中有手性碳原子构型相反但并不呈镜像关系的一对。
  • 差向异构体 (epimer)：只有一个手性碳构型不同的一对非对映异构体。
常见单糖名称 结构
葡萄糖 一种标准的六碳糖
半乳糖 葡萄糖的差向异构体
甘露糖 葡萄糖的差向异构体
果糖 葡萄糖的酮糖形式
核糖 一种标准的五碳糖
阿拉伯糖 核糖的差向异构体
木糖 核糖的差向异构体
单糖的环状结构和异头物

醇羟基容易与醛或酮形成半缩醛或半缩酮。直链的单糖分子在分子内也可能发生类似反应，形成环状结构，其中醛醣环化形成环式半缩醛，酮糖环化形成环式半缩酮。

在单糖由直链变为环状结构以后，原来的羰基碳称为新的手性中心，产生 α 和 β 两种异构体。

异头物 (anomer)：在半缩醛或半缩酮碳上形成的差向异构体。新出现的手性碳称为异头物碳 (anomeric carbon)。

半缩醛或半缩酮羰基在环的下方，与原来编号最高的手性碳上的羟基具有相同取向的称为 α 异头物，反之则称为 β 异头物。

单糖的构象

葡萄糖的吡喃环和环己烷环相似，也有椅式构象和船式构象，其中椅式构象扭张强度较小更稳定。

单糖的反应性质

变旋、异构、氧化还原、成脎/成苷、呈色。

单糖的衍生物

在特定酶催化下可进行各种修饰形成一系列衍生物：氨基糖、氧化糖、脱氧糖、糖醇、糖苷等。

寡糖

也称低聚糖，由 2~10 个单糖分子缩合并以糖苷键相连。

二糖是最简单的寡糖，其中一个单糖单位的链接碳总是 C1，另一个单糖的连接碳位置可变。

寡糖分子中异头体 C 上的半缩醛羟基以游离形式存在的一端称为还原端，参与形成糖苷键的一端称为非还原端。书写寡糖序列时非还原端在左，还原端在右，标明各单糖单位的名称、构型、相互间的连接方式和异头体构型。

多糖

由多个单糖分子缩合而成，其中由相同的单糖分子组成为同多糖，含有不同种单糖单位的称为杂多糖。最常见的单糖是 D-葡萄糖，某些单糖衍生物也出现在某些多糖分子中。

多糖中糖苷键的类型直接与机械强度和溶解性相关。无确定的相对分子质量，与单糖相比无变旋现象和还原性，无甜味。可分为贮能多糖和结构多糖。

淀粉（贮能多糖）

分为直链淀粉、支链淀粉。直链淀粉能在水中形成胶束悬液，形成疏水螺旋构象，碘插入到螺旋中间产生蓝色；支链淀粉在水中也形成胶束结构，但碘反应产生紫红色。

右旋糖酐（贮能多糖）

主要以 α-1,6 糖苷键相连的分支多糖，通常存在于酵母和细菌中，是牙菌斑的重要成分，常用作层析柱的支持介质。

糖胺聚糖 GAG（结构多糖）

也叫粘多糖，主要参与细胞外功能，是由多个重复的二糖单位组成的无分支的杂多糖，通常与核心蛋白以共价键相连构成蛋白聚糖。在体内占据很大的空间，形成水合的胶状物。

糖缀合物（信息多糖）

糖缀合物：糖与非糖物质以共价键相连的复合物。可分为：糖蛋白和蛋白聚糖、肽聚糖、糖脂和脂多糖。

  • 肽聚糖
    又称粘肽，是细菌细胞壁中的一种特殊成分。

第 16 章 脂质与生物膜

知识概要

脂质的化学结构及其功能

脂质也称为脂类或类脂，是生物体内一类范围很广、化学结构迥异、生理功能各不相同的有机分子，它们都具有一个共同的物理性质即一般不溶于水或微溶于水而溶于有机溶剂。许多脂为两性分子，这样的性质对于形成生物膜的结构至关重要。

简单脂

是游离的脂肪酸以及由游离的脂肪酸和醇形成的酯，包括脂肪和蜡。其中脂肪就是甘油三酯。

  • 按照碳原子数目：奇数脂肪酸/偶数脂肪酸（绝大多数天然脂肪酸为偶数）
  • 按照碳链饱和度：饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸（天然不饱和脂肪酸双键多为顺式，又分为单不饱和/多不饱和）
  • 按照营养价值：必需脂肪酸（亚油酸、α-亚麻酸）/非必需脂肪酸
复合脂

除含有脂酰基和醇基团以外，还有一些非脂成分，如磷酸基团、糖基和胆碱等。根据非脂成分的不同，复合脂可以分成磷脂（甘油磷脂/鞘氨醇磷脂）和糖脂（甘油糖脂/鞘氨醇糖脂 [中性/酸性]），均为两性脂，是构成生物膜的主要成分。

异戊二烯类脂

衍生于异戊二烯，在结构上可被剖析成若干个异戊二烯单位，它们主要包括萜、脂溶性维生素和胆固醇及其衍生物。

功能
  • 能源物质
  • 疏水屏障
  • 功能性：保护/浮力/辅酶/激素/信号转导

==生物膜的结构==及其功能

生物膜的化学组成

双分子层，蛋白质，糖类

生物膜的基本结构与性质

脂双层结构。膜蛋白是生物膜功能的主要执行者，可分为外周蛋白/内在蛋白/脂锚定蛋白。

基本性质
  • 流动性
    流动镶嵌模型，影响因素：温度/膜脂组成
    • 约 50% 处于液态，否则细胞会死亡
    • 对于膜蛋白运动非常重要
    • 有利于膜的融合
  • 不对称性
    • 结构不对称性
    • 功能不对称性
  • 生物膜的相变和分相
    相变：固态-液态转变的过程。
    分相：生理温度下膜脂双分子层中相当一部分表现为流体/液晶态，另一部分表现为固体/结晶态。
功能
  • 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；
  • 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排出；
  • 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息的跨膜传递；
  • 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；
  • 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；
  • 参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。
物质的跨膜转运
  • 小分子：被动（简单扩散、易化扩散、通道转运）/主动（初级主动转运/次级主动转运）
  • 大分子：胞吞/胞吐

第 17 章 激素及其受体介导的信号转导

知识概要

激素的一般性质

经典定义：由特定的组织产生并分泌到血流中，通过血液的运输到达特定器官或组织，而引发这些器官或组织产生特定的生理生化反应的一类化学物质。

更广泛的定义：激素是一类非营养的、微量（微摩尔或更低浓度）就能发挥作用的细胞间转导信息的化学物质。

  • 产生和分泌激素的为复杂的多细胞生物
  • 浓度低：动物在静息状态下，血液肽类激素的浓度为 10^-12^ ~ 10^-10^ mol/L，固醇类激素的浓度为10^-10^ ~ 10^-8^ mol/L。
  • 能产生强烈的生物学作用
激素的分类
  • 按化学本质：肽类或蛋白质激素/氨基酸衍生物激素/固醇类激素/脂肪酸衍生物激素
  • 按溶解性质：水溶性激素/脂溶性激素
动物激素的进一步分类

就动物而言，分泌激素的细胞被称为内分泌细胞，受激素作用的细胞被称为靶细胞。

  • 内分泌激素
  • 神经内分泌激素
  • 旁分泌激素
    只作用于邻近的细胞，如前列腺素、阿片肽以及一些多肽生长因子
  • 自分泌激素
    作用于原来分泌它的细胞，如刺激 T 细胞分裂的白细胞介素-2 和某些细胞癌基因的产物
  • 内部分泌激素
    在细胞内合成以后不需要分泌到胞外，而是在原来的细胞内发挥作用。
激素的定量

化学分析法/生物活性测定法/放射免疫测定法

激素作用的基本过程
  1. 激素的合成和分泌；
  2. 激素被运输到靶细胞；
  3. 激素与靶细胞膜或靶细胞内的特异性受体结合，导致受体的激活；
  4. 靶细胞内的一条或几条信号转导途径被起动；
  5. 靶细胞内产生特定的生理或生化效应；
  6. 信号的终止。

==激素的一般特征==

  • 高度的特异性：由受体决定
  • 高效性：微量就能发挥作用。
    一是激素与受体的亲和力极高，二是激素在作用过程中存在级联放大的机制。
  • 水溶性激素的作用往往需要“第二信使”
    已发现的有：cAMP, cGMP, IP3, Ca^2+^, 甘油二酯 (DG), Ceramide, NO等。
  • 可能产生“快反应”或“慢反应”
  • 脱敏性
  • 时效性
受体 receptor

存在于细胞中的一种特殊成分，能够识别并结合源自细胞外的各种信号配体，形成可逆二元复合物，引发特定生物学效应。本质是蛋白质。具有：

  • 与配体结合的高度专一性
  • 与配体结合的可逆性
  • 与配体结合的高亲和性
  • 与配体结合的饱和性
  • 与配体的结合可产生强大的生物学效应（激动剂和拮抗剂）
受体的分类
  • 细胞内受体（细胞质/核）
  • 细胞膜受体
    • G 蛋白偶联受体 (GPCR)
    • 离子通道受体
    • 酶受体
    • 无酶活性但直接与细胞质内酪氨酸蛋白激酶 (TK) 相联系的受体

==激素作用的详细机制==

脂溶性激素的作用机制
  1. 通过细胞质受体（皮质醇和醛固酮）
  2. 通过核受体（T3/T4、孕激素和雌激素）
  3. 通过膜受体（油菜素内酯、爪蟾的孕激素）
水溶性激素的作用机制
  1. GPCR 系统 (AC & PLC)
  2. GC 系统（酶受体）
  3. RTK 系统（酶受体）
  4. NO 系统
  5. 其他系统
GPCR 系统

一般由激素、GPCR、异源三聚体 G 蛋白、效应器 (AC & PLC)、第二信使、蛋白质激酶、靶蛋白组成。

  • 腺苷酸环化酶 (AC) 系统 (PKA)
    激素、GPCR、Gs 蛋白、腺苷酸环化酶 (AC)、cAMP、PKA、靶蛋白。
  • 磷脂酶 C (PLC) 系统 (PKC)
    激素、GPCR、Gq 蛋白、磷脂酶 C-β、DG/DAG, IP3, Ca^2+^、PKC & CaMPK、靶蛋白。
  • 视觉和嗅觉转导系统

G 蛋白：尿苷酸结合蛋白，能结合和水解 ATP。有两种形式，取决于结合 GDP/GTP。结合 GTP 一般激活 G 蛋白。

  • 异源三聚体 G 蛋白：α 亚基、β 亚基和 γ 亚基；α 亚基结合 GTP，active state: Gα-GTP

  • 小 G 蛋白 (Small G-proteins)

    • Ras-生长因子的信号转导

    • 翻译的起始因子、延伸因子和释放因子-蛋白质生物合成

    • Rab-小泡定向和融合

    • ARF-形成小泡外被体

    • Ran-蛋白质进入或离开细胞核

    • Rho-肌动蛋白骨架的调节

信号终止：

  • HR 解离，受体脱敏
  • 第二信使的降解或去除：phosphodiesterase
  • G 蛋白的自我灭活
  • 蛋白质的去磷酸化: phosphatase
受体鸟苷酸环化酶 (GC) 系统/PKG 系统（酶受体系统）

实例：心房利钠肽 (ANF)

  • 不需要 G 蛋白
  • 酶受体：GC
  • 第二信使：cGMP
  • 蛋白激酶：PKG
受体酪氨酸蛋白激酶 (RTK) 系统（酶受体系统）

发挥作用的激素是胰岛素和许多生长因子，受体具有潜在的酪氨酸蛋白激酶活性，具有高度保守结构。一般会激活特定基因表达，是将胞外信息转导到核内的最重要途径。酪氨酸残基的脱磷酸化由专门的蛋白质酪氨酸磷酸酶催化完成。磷酸酶的作用是逆转由激酶引发的反应，其中某些磷酸酶也作为受体 (e.g. CD45 antigen) 定位在细胞膜上。该系统与细胞癌变有密切联系。

  • 激素：胰岛素、生长因子等
  • 受体：RTK
  • ==接头蛋白==：Grb2/Sem-5
  • GEF：SOS 蛋白
  • 小 G 蛋白：Ras 蛋白
  • 蛋白质激酶
    MAPKKK (Raf) – Ser/Thr
    MAPKK (Mek) – Ser/Thr/Tyr
    MAPK – Ser/Thr
  • 转录因子：Fos, Jun, Myc, SRF, TCF
  • 信号终止：PPP/GTP
NO 系统

NO 合酶催化 Arg 转变。作用途径：旁分泌信号，作用局部区域，半衰期 1~5 sec. 介导多种生理功能（血管扩张/作为自由基杀死细菌、寄生虫和肿瘤）

  • 血管扩张

    NO 是已知最强的血管扩张剂。乙酰胆碱、肾上腺素、舒缓激肽和 γ-氨基丁酸作为第一信使可刺激血管内皮细胞产生 NO，NO 可视为这些激素的第二信使。NO 在平滑肌细胞则作为第一信使，产生第二信使 cGMP 和 Ca^2+^（或第三信使）。

    硝化甘油是治疗心脏病和梗塞的特效药，可以在体内释放 NO。

无酶活性但直接与细胞质内酪氨酸蛋白激酶 (TK) 相联系的受体系统

STAT/JAK 系统，实例：脂瘦素 (leptin)

这类膜受体尽管没有任何潜在的酶活性，但是在与相应的配体结合以后，也能产生与 RTK 系统类似的反应。

  • 配体、受体
  • JAK1、JAK2
  • 信号转导物与转录激活剂 (STATs)